Fundamentos da Engenharia Genética

A Engenharia Genética permite manipular directamente os genes de determinados organismos com objectivos práticos.

 Técnicas

Tecnologia de DNA recombinante

Permite combinar na mesma molécula de DNA genes provenientes de fontes diferentes, mas não necessariamente de espécies diferentes, dando origem a uma molécula de DNA recombinante (rDNA).

Baseia-se na utilização de ferramentas moleculares como as enzimas de restrição, as ligases do DNA e os vectores.

·        Enzimas de restrição – reconhecem determinadas sequências de DNA e cortam a molécula nesses locais. As zonas de restrição correspondem a sequências de DNA curtas e simétricas que se lêem da mesma forma nas duas cadeias na direcção 5'-3'.

o   As enzimas de restrição são bastante específicas e ocorrem naturalmente em bactérias. Protegem as bactérias dos ataques dos vírus, uma vez que reconhecem e cortam sequências específicas do DNA viral, inactivando-o. O DNA bacteriano está protegido da actividade das enzimas de restrição.

o   A actividade das enzimas de restrição dá origem a fragmentos de DNA em dupla hélice – fragmentos de restrição - com extremidades em cadeia simples – extremidades coesivas.

o   Verifica-se complementaridade de bases do DNA nas extremidades coesivas de diferentes fragmentos de restrição obtidos com a mesma enzima.

§  As extremidades coesivas emparelham através de ligações de hidrogénio entre bases complementares e podem unir-se pela actividade de ligases do DNA que catalisam a formação de ligações fosfodiéster.

·        Vector – entidade, constituída por DNA, que transfere o DNA de uma célula ou de um organismo dador para uma célula ou um organismo receptor.

o   Os vectores mais utilizados são os plasmídeos e os bacteriófagos.

o   Os plasmídeos são pequenas moléculas circulares de DNA que ocorrem naturalmente em algumas bactérias, leveduras e células vegetais.

¨     Processo de obtenção e expressão de uma molécula de DNAr:

1.   Selecciona-se uma molécula de DNA dadora, contendo o gene com interesse que se pretende transferir e clonar, e um vector adequado.

2.   A molécula de DNA e o vector são tratados com a mesma enzima de restrição, que corta as duas moléculas em regiões com a mesma sequência de nucleótidos.

3.   Misturam-se os fragmentos de restrição da molécula de DNA e o vector e juntam-se ligases do DNA. O vector e os fragmentos de restrição emparelham pelas extremidades coesivas, que são complementares, e a ligase estabelece a ligação.

4.   O vector, contendo o DNA dador, é transferido para uma célula ou organismo receptor.

5.   O DNA dador é incorporado no genoma da célula ou organismo receptor, que passa a possuir um DNA recombinante.

6.   Um meio selectivo ou testes químicos permitem identificar as células que exprimem o gene desejado. No processo descrito formam-se fragmentos de restrição que não têm o gene desejado e nem todas as células receptoras incorporam o DNA dador.

¨     Aplicações:

·       Investigação fundamental: torna possível isolar genes de organismos complexos e estudar as suas funções a nível molecular.

·       Obtenção de OGM: os OGM são organismos em cujo genoma foram introduzidos genes que conferem características vantajosas.

DNA Complementar – DNAc

¨     DNA complementar (DNAc) – molécula de DNA sem intrões que é directamente transcrita numa molécula de RNAm funcional. O processo de obtenção de DNAc é o seguinte:

1.   Isola-se uma molécula RNAm funcional das células.

2.   Adiciona-se transcriptase reversa e nucleótidos livres. A transcriptase reversa catalisa a síntese de uma cadeia simples de DNA a partir de um molde de RNAm.

3.   Junta-se uma enzima que degrada o RNAm que serviu de molde e DNA polimerase que catalisa a formação da cadeia complementar do DNA.

o   O DNAc pode ser inserido através de um vector contendo o promotor e sequências reguladoras.

o   Todos os DNAc que se sintetizam a partir do RNA podem ser clonados em bactérias, originando uma biblioteca genómica (permite conservar cópias do DNA, permitindo assim acelerar o processo, evitando alguns processos laboratoriais como o isolamento do DNA.)

¨     Aplicações:

·       Obtenção de cópias de genes que codificam produtos com interesse – torna possível a produção de proteínas humanas por procariontes que podem ser cultivados facilmente.

Reacção de Polimerização em Cadeia (PCR)

Desta forma, procede-se à amplificação dessa porção do DNA, o que é extremamente importante quando a amostra de DNA que se possui para a análise é muito reduzida.

¨     Procede-se ao aquecimento da amostra com vista à separação das duas cadeias. De seguida, fornecem-se nucleótidos e DNA polimerase, para que se produzam uma dupla cadeia a partir da cadeia simples. Repetem-se estes passos o número de vezes necessário até se obter o número de cópias pretendido.

A DNA polimerase utilizada provém de um organismo termófilo, permitindo assim conciliar as elevadas temperaturas a que decorre a técnica com a estabilidade da polimerase.

¨     Aplicações:

·       Obtenção de grandes quantidades de DNA em pouco tempo, a partir de uma quantidade muito pequena. Esse DNA pode ser posteriormente utilizado em técnicas de recombinação de DNA ou em fingerprint.

DNA Fingerprint

¨     No genoma humano existem sequências de DNA repetitivas que são reconhecidas e cortadas por determinadas enzimas de restrição. Estas enzimas dividem o DNA em fragmentos cujas dimensões e composição em nucleótidos variam de pessoa para pessoa e reflectem as diferenças entre os alelos dos vários loci.

¨     Diferentes fragmentos de DNA movimentam-se de modo diferente quando submetidos a electroforese (técnica em que determinadas moléculas são sujeitas à acção de um campo eléctrico num meio poroso) e o resultado é um padrão de bandas que difere de indivíduo para indivíduo.

¨     Aplicações:

·       Investigação criminal, forense e histórica – a técnica permite partir de material biológico deixado num local (cabelo, sangue, esperma...) e compará-lo com o dos suspeitos; permite a identificação de cadáveres.

·       Determinação de paternidade – a comparação das impressões digitais genéticas dos progenitores e do descendente permite excluir a paternidade ou confirmá-la com um elevado grau de certeza.

Terapia Génica

¨     A terapia génica consiste na introdução de genes clonados em células de um organismo com o objectivo de curar uma doença. A terapia génica é uma das mais promissoras técnicas de tratamento de doenças que resulta de defeitos genéticos.

OMG’s

OGM, significa organismos geneticamente modificados. Assim podemos dizer que a sua estrutura foi modificada por introdução de genes de outro ser, (organismo). Através desta técnica consegue-se atribuir características completamente distintas das originais do organismo receptor.

¨     Vantagens das OGM:

·       Melhoramento das propriedades nutritivas;

·       Produção em grande número de vários alimentos;

·       Aumento da resistência das novas espécies a pragas e doenças;

·       As novas espécies tornam-se mais resistentes a herbicidas;

·       Estes tornam-se mais tolerantes às condições ambientais adversas;

·       Produção de espécies com novas características desejáveis.

¨     Desvantagens das OGM:

·       As ervas daninhas tornam-se mais resistentes o que pode dar origem a novas doenças;

·       Potencial aumento dos sintomas de alergia a certos alimentos;

·       Empobrecimento da biodiversidade;

·       Aparecimento de novos vírus na Natureza;

·       Prejudicarão do tratamento de doenças em homens e animais, devido à existência de genes resistentes a antibióticos em várias plantações;